NCTC clone 929 [L cell, L-929]（小鼠成纤维细胞）

细胞操作说明
请仔细阅读本操作说明及相应的细胞说明书。
一、 收货
<1>本公司细胞发货有四种形式：T25瓶、离心管、血清及干冰。
① T25是用T25细胞培养瓶直接发货的形式。收到细胞后，拆开包装T25瓶的自封袋，不拆封口膜，表面喷75%酒精消毒后显微镜观察细胞状态（有条件可以拍下此时细胞照片）。将细胞放入37度培养箱平衡两小时以上，再处理细胞。首先将T25中培养基取出装好备用，如细胞密度高于80%，可以直接消化传代，相反则加入5-6mL培养基放回培养箱继续培养即可。
② 离心管是用15mL离心管发货的方式，只用于悬浮细胞发货。收到细胞后消毒处理及平衡参考上述T25瓶。平衡完成后，离心（1000rpm，3min）收集细胞，弃上清，用新的培养基重悬细胞并接种至培养瓶或皿中，放回培养箱继续培养。
③ 血清是用牛血清直接发货的形式，是细胞冻存管加入含有细胞的牛血清的形式。收到细胞后，拆开自封袋，冻存管表面喷75%酒精消毒后，在超净台中打开冻存管，将细胞用1mL枪头轻轻几次以将细胞吹匀，接种至含有预热的培养基的培养瓶或皿中，显微镜下观察细胞是否吹匀，如果没有吹匀，继续吹匀至3-5个细胞一团，放回培养箱继续培养。
④ 干冰是用本公司冻存液冻存细胞后，直接用干冰将冻存的细胞冷冻发货的形式。收到细胞后按照细胞复苏的步骤操作即可。
<2>相关问题
① 如不能在收到细胞后及时操作细胞，T25及离心管发货的细胞可以消毒后在37度过夜，血清发货的细胞可以在室温下静置1-2天（注意不要放冰箱），干冰发货的可以在确认干冰未完全升华时将细胞直接放回液氮或者-80度冰箱，若干冰完全升华，请即刻复苏细胞。
② T25瓶及离心管在培养箱平衡是为了让细胞尽快适应培养箱环境，同时使部分因运输导致脱落的细胞贴壁，此步骤非常必要。T25瓶如果在显微镜下可以看到部分不贴壁的细胞，可以收集上清后离心（1200rpm，5min）后，将沉淀用新的培养基重悬后接种至新的培养瓶或皿中。
③ 部分细胞在运输过程中，由于不断震荡及环境不适，可能导致细胞破碎死亡，从而使培养基中漂浮很多细胞碎片及颗粒状物质。这种情况下，平衡后，贴壁细胞用PBS洗两遍在加新的培养基培养或者传代至新瓶中培养即可；悬浮细胞可以离心（1000rpm，3min）收集细胞，并用PBS重悬后再离心一次，再用新的培养基重悬并接种细胞。
二、 细胞培养及传代
<1>细胞培养
① 细胞请于细胞培养箱中培养，大部分细胞是37℃，5% CO2，湿度100%环境下培养的。有极少部分细胞培养条件不一致，请仔细阅读相应的细胞说明书，使用正确的培养基及培养条件；
② 细胞于培养瓶或皿中培养，加入适量说明书上标注的细胞相应完全培养基（一般液面高度2-3mm即可）。
<2>细胞传代（以下步骤适用于10cm皿）
① 细胞培养至密度达80%以上时即可传代，先将细胞培养基取出3mL用15mL离心管装好，其他培养基全部吸干舍弃；
② 培养皿加入2-3mL无菌PBS，轻轻晃动皿，使PBS浸洗到皿底所有部位，PBS吸干舍弃；
③ 加入1mL胰酶，轻轻晃动皿，使胰酶浸没到皿底所有部位，将皿盖好放入培养箱中消化；
④ 3min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞不再贴壁，即可加入第一步收集的培养基混匀；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至不贴壁为止；
⑤ 将细胞悬液均匀分成几份，分别加入不同培养皿中，补加新培养基后放回培养箱培养。
<3>相关问题
① 部分细胞在传代后时，会有以下现象：细胞内会有黑色小点、细胞间隙有些颗粒物、培养基漂浮一些死细胞或者细胞长的极慢。出现以上现象时，可以咨询本公司技术人员此现象是否正常及相关处理方式，不要频繁换液，大多数细胞1周换液2-3次即可。
② 细胞碎片较多、背景较脏时，贴壁细胞用PBS漂洗两次、悬浮细胞打散后低速离心（900rpm，3min）能有效改善。
③ 传代比例建议1:2-1:3，长得比较快的细胞可以1：3，比较慢的按1:2传代。传代后，建议不要使用传代前培养所使用的培养基，会有大量细胞碎片甚至导致细胞死亡的风险。
④ 细胞状态不好或者生长极慢的时候，可以通过增加血清浓度调整细胞状态及生长速度。
⑤ 请不要随意更换培养基，因实验需要，可以逐步驯化。
悬浮传代：混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗一次。
 
三、 细胞冻存
<1>冻存操作
① 冻存液配方：建议使用92%FBS+8%DMSO，客户自身实验室所使用的冻存液也可以适用，血清浓度不低于30%，DMSO含量不高于12%即可。
② 收集细胞按照以上细胞传代步骤操作至第④步后，将细胞悬液收集入15mL离心管，离心（1200rpm，3min）；
③ 弃上清，加入配制好的冻存液，重悬细胞，悬液加入无菌冻存管中；
④ 将冻存管在4℃静置10min，后将之正置于室温下的厚壁有盖泡沫盒中，盖紧盒盖，放入-80℃冰箱过夜，第二天放入液氮即可长期保存。
<2>相关问题
① 10cm皿的细胞长满一般可以冻存2-3管，部分细胞长的比较慢，冻存的细胞密度要稍微大点，以防止复苏后生长困难。
② 冻存液中含的DMSO请使用细胞级DMSO，同时浓度不要太高。部分细胞在10%DMSO条件下冻存会死亡，所以DMSO浓度5%-8%是比较推荐的浓度。
③ 细胞冻存及复苏遵循慢冻快融的原则，即冻存时温度不能急剧下降，应控制温度缓慢下降。复苏时应快速融化，融化后尽快加入培养基中。
④ 冻存时建议设置冻存检测，即取0.2-0.3mL的冻存液重悬的细胞于一个冻存管中，与正常体积冻存的细胞共同冻存，至液氮后复苏检查冻存结果。冻检合格前，留一部分细胞继续培养，以防万一。
四、 细胞复苏
<1>复苏步骤
① 将冻存细胞从液氮中取出后迅速放入37℃温水中摇晃融化，时间1min左右；
② 于1000rpm离心1min，弃冻存液，加入1mL新的完全培养基重悬细胞；
③ 接种至新培养瓶或皿中，补加足量完全培养基，放入培养箱中培养。
<2>相关问题
① 复苏过程应迅速操作，时间不能太长。
② 复苏过程中注意污染，小心操作。